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文|谢子淮

编辑|谢子淮

细菌抗性表面、软机器人、药物输送系统、传感器和组织工程，都准备好突出控制生物界面相互作用能力的重要性。更加专注于为 DNA、药物输送、蛋白质和基于细胞的应用设计智能刺激响应界面。在这种情况下，热敏材料，尤其是聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAm）已广泛用于组织工程应用，以控制蛋白质和细胞的分离，同时对蛋白质和细胞结构构象的侵入性影响最小。智能生物界面的特性可以通过其成分和聚合物结构来控制。

(资料图片)

聚的特性、温度

能生物界面的设计在各种应用中基于刺激响应表面，根据涉及生物粘附、微生物或哺乳动物细胞的操纵、蛋白质的生物吸附等生物工程应用的类型，可以通过调整材料的性质、特性、化学性质以及获得方法等因素，获得能够对不同刺激（例如温度、pH值、光和磁场）做出响应的各种表面。

在这些智能或刺激响应材料中，热响应聚合物是一类智能聚合物，其在温度变化下表现出快速、可逆的相变/相分离现象。

热敏行为是基于智能聚合物的可逆溶解性，该可溶性随温度升高超过临界转变温度（下临界溶液温度（LCST）或"云点"）而发生变化。

热敏聚合物有几个不同的类别，其具有不同的相变温度，例如，聚乙二醇的相变温度为100°C，聚(N-烷基取代丙烯酰胺)和聚(N-乙烯基烷基酰胺)的相变温度在32°C至39°C之间，具体取决于聚合物的分子量，还有其他聚合物如聚(N-乙烯基哌啶)的低相变温度为4-5°C。

特别是聚(N-异丙基丙烯酰胺)（pNIPAm）涂层在基础发育生物学研究和再生医学领域具有巨大的潜力，因为它是在生理温度范围内响应的热敏智能生物界面。

其化学式为（C6H11NO）n，呈白色固体形式，从1968年首次报道pNIPAm浓度对相变温度的影响开始，已经进行了各种研究，涉及在约32°C的温度下通过凝胶进行可逆的膨胀/收缩循环，而不会出现材料疲劳现象。

关于收缩机制的最早研究之一表明，在LCST（38.5°C）时，束缚的水分子被释放，导致塌陷现象，随后在表面形成一层水膜。

根据聚合物层的致密程度，这个过程可能具有双相动力学对于致密表面而言较慢，对于较松散的表面而言较快。

在水中的溶解度由与水分子的氢键结合决定，随着温度升高氢键降低，最终导致相分离。

形成两相：几乎不含聚合物的水相和富含聚合物的相，可以通过离心、倾析或过滤轻松分离。

发生相变的温度也取决于聚合物的浓度和分子量，并且可以通过掺入不同的亲水性共聚单体或偶联其他活性化合物来进一步改变。

或者在热敏聚合物中，较高温度下的相变是聚合物分子之间疏水相互作用的结果，通过增加盐浓度，浊点可以转移到较低的温度。

如果添加有机溶剂、洗涤剂和其他活性剂会破坏疏水相互作用，导致浊点温度升高。

获得 pNIPAm 表面的方法

现在有多种方法可以获得不同形式的 pNIPAm 表面，例如膜、薄膜和纳米粒子。

在细胞培养基质或药物输送平台的背景下，pNIPAm 生物界面的理想用途是作为受控涂层，基于涂层对生物介质和生物介质内部的响应与其结构和建筑特征密切相关的事实，设想和开发了多种方法以满足特定要求。

有些情况下基于 pNIPAm 的某些表面甚至在 LCST 之上也不支持细胞粘附，所以它们不适合作为培养基质。

这就是为什么表面制造方法的选择与在所需应用中使用智能涂层的能力直接相关的原因。

在大范围应用中获得基于刺激响应聚合物的智能生物界面如下：辐射交联通过使用这种方法，通过在辐照初始化下连接聚合物链来增加聚合物的分子量。

辐射产生自由基，自由基重新结合形成交联（取决于聚合物类型和辐射剂量）。接枝聚合可以通过γ射线、迅捷重离子和电子束（e-beam）等高能辐照引发。

原子转移自由基聚合 (ATRP) 是另一种获得明确定义和高官能化（共）聚合物的简单方法。

它可以很好地控制聚合物的功能、拓扑结构和组成，使用表面引发的原子转移自由基聚合 (ATRP) 技术获得的 pNIPAm 表面显示出很强的粘合性能，可用于组织工程应用的细胞片。通过将引发剂的自组装单分子层与原子转移自由基聚合 (ATRP) 相结合，可以获得相对均匀的聚合物刷。

聚合物的电子束 (e-beam) 加工也广泛用于聚合物链的交联，以改善化学性能，该方法包含两个步骤：首先用 NIPAm 单体溶液均匀地涂覆表面，然后使用 0.3-MGy EB 对其进行照射 和第二次用去离子 (DI) 水清洗非接枝 NIPAm 单体。

据观察，细胞粘附取决于通过电子束获得的 pNIPAm 层的接枝密度（对于高接枝密度，细胞附着/脱离显着降低）。

同时，观察到如果厚度增加约 30 nm，接枝的 pNIPAm 表面在任何温度下都不再支持细胞粘附。

等离子聚合或等离子沉积的 pNIPAm 涂层提供了一个热响应表面，该表面共价连接到固体基质上，并很好地保留了单体的完整性， 该方法基于逐渐减少等离子辉光放电以在外表面沉积 pNIPAm 涂层。

该聚合物保留了其单体结构，并保留了相变。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 测量表明，等离子放电后，官能团保持不变。

细胞培养研究以及在 pNIPAm 表面进行的细胞热分离证明是成功的，但没有观察到薄膜厚度对细胞的影响。

大气压等离子体处理后进行自由基接枝共聚也用于在尼龙上获得 pNIPAm 表面。大气等离子体具有引发接枝共聚的活化能力 。

使用聚合物薄膜对大表面积进行改性的其他方法包括溶剂浇铸、浸渍、旋涂或喷涂。这些方法已被用于创建散装 pNIPAm 薄膜，这些薄膜没有接枝到基板上，而是与一些生物活性剂结合并沉积在固体支持物上，如组织培养级聚苯乙烯 (TCPS) 或玻璃。

产生热响应表面的另一种方法涉及使用紫外线照射来产生交联的表面层，该方法可用于具有热响应区域的工程微图案表面。

第一步涉及使用光刻，然后用溶剂清洗阴影区域，通过使用这种方法，细胞可以选择性地从移植区域分离，从而对粘附细胞的分离提供良好的空间控制，所以在共培养系统中不同细胞类型的空间分布方面具有很高的潜力。

前面描述的大多数方法使用疏水到亲水的转换来恢复细胞片，而不是涂层的分解，仅在溶剂浇铸或旋涂的情况下存在。

虽然大多数方法确保涂层不会与细胞片一起收获，使细胞结构在分离后不含不需要的可溶性聚合物，但仍然存在一些缺点，例如成本高、在控制表面密度、形态学方面缺乏灵活性或薄膜的厚度，附着在基质上，甚至由于细胞微环境内的生理改变而导致的异常细胞活动。

pNIPAm 薄膜工程的 MAPLE 技术

由于生物工程领域中大部分应用都需要受控的生物涂层和无菌条件，基于激光的技术（例如基质辅助脉冲激光蒸发—MAPLE）是一种无接触技术，也很容易与所需的无菌工艺集成。

或者通过控制MAPLE过程中的激光和靶材参数，可以轻松实现对单层或多层薄膜的厚度、多孔性和结构的整体控制，不受材料的使用或沉积结构的限制，能够在工程上灵活制备各种简单或混合材料（纳米颗粒、聚合物、陶瓷和生物化合物）。

虽然MAPLE技术已成功应用于各种生物材料，但只有两个研究组最近使用激光蒸发工程制备了简单的pNIPAm涂层，用于哺乳动物细胞的附着和脱附研究，或者具有抗菌活性的混合抗菌寡聚（对苯乙炔）（OPE）-PNIPAAm涂层，该涂层还具有按需释放细菌的功能。

在最后一个例子中，使用顺应共振红外基质辅助脉冲激光蒸发（RIR-MAPLE）的连续共沉积模式，在基片上沉积了具有定制化学组成的OPE-PNIPAAm多功能薄膜。

MAPLE 工艺在真空室中进行，涉及使用外部激光源（紫外线、准分子、红外线）、固体低温靶和接收基板。

在理想的 MAPLE 系统中，要沉积的材料（客体材料）混合或悬浮在溶剂（主体基质）中，并使用液氮在铜支架中快速冷冻。然后将装有冷冻靶的铜支架放入真空室内。

为防止激光照射过程中靶材熔化，必须使用设计用于在沉积室内传输和循环液氮的冷却系统持续冷却铜支架。

为了进一步防止熔化，在沉积过程中旋转靶架。这种旋转有助于避免目标局部过热，并防止由于多个激光脉冲而对铜支架进行钻孔。

由于吸收到目标中的激光能量，材料从固体低温目标中喷射出来，主体基质溶剂蒸发，将客体材料携带并沉积到位于目标上方的基板上，基板通常放置在距离目标矩阵 3-4 厘米的固定距离处。

使用 PBS（磷酸盐缓冲盐水）中的异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的 BSA 对 MAPLE 获得的涂层进行蛋白质吸附研究。

使用配备有 FITC 滤光片的显微镜测量涂层的总荧光。所有表面的显微镜设置（包括曝光时间、放大倍率和图像区域）都保持不变。

使用 CCD 相机（ANDOR iXon DU897 E-CSO-UVB）和 Olympus IX71 显微镜拍摄与 BSA 孵育前后的每个涂层的重复图像。

BSA 发出的总荧光通过减去每种涂层类型的背景荧光来确定，该计算针对具有不同粗糙度值的涂层进行：粗糙度在 7-30 nm 范围内的零个、一个和两个样品，以及粗糙度在 110-130 nm 范围内的三个和四个样品。

为了提供视觉示例，图像左侧表示低粗糙度表面 (7-30 nm) 的 AFM（原子力显微镜）图像，而右侧显示具有较高粗糙度（110-130 nm）的 pNIPAm 涂层的 AFM 图像纳米）。

蛋白质吸附和细胞可逆附着与pNIPAm密度、嫁接或构象与基底之间存在相关性，在通过MAPLE获得的pNIPAm涂层中，使用了一种模型蛋白质（牛血清白蛋白（BSA））来探测涂层的界面特性的变化，并观察到了与粗糙度表面相关的两种趋势。

对于低粗糙度表面（样品0-7 nm、1-20 nm和2的粗糙度达到30 nm），在21°C下几乎没有蛋白质吸附，而在更密集和粗糙的pNIPAm涂层上（样品2-110 nm和3的粗糙度达到130 nm）观察到蛋白质的增加。

pNIPAm表面性质（粗糙度）的变化会影响蛋白质的吸附，在37°C下，密集且粗糙的涂层上蛋白质的吸附较低，在低粗糙度表面上蛋白质的吸附较高，这与其他方法得到的pNIPAm的测量结果相矛盾。

这种差异可以通过膨胀比例来解释，随着材料密度的增加，更密集涂层中的链条在完全水合时膨胀较少。

当将温度对涂层高度的修饰（约24 nm）与蛋白质的尺寸（长度14 nm，高度和宽度4 nm）进行比较时，可以假设最低密度不足以超过初级吸附，蛋白质能够穿透粗糙的涂层并吸附到底部表面上。

薄膜的不规则性或粗糙度被证明是影响吸附蛋白质的活性的重要因素之一。

我们介绍了智能涂层工程的新的和迅速出现的重要性，重点关注通过基于基质辅助激光蒸发的方法获得的智能热响应 pNIPAm 界面，还强调了通过基于 MAPLE 的方法获得的热敏涂层特性以及一些沉积参数并用于生物测定体外暗示 BSA 模型蛋白、哺乳动物细胞和微生物。

MAPLE 作为获得具有生物应用特定特性的智能聚合物涂层的技术，不仅可以调整 pNIPAm 层的厚度，这是细胞附着中的一个重要参数，而且还可以调整沉积薄膜的形态以影响蛋白质和细胞分离及其在液体介质中增加的稳定性。尽管基于刺激响应材料的智能涂层领域取得了重大进展，但本章讨论的材料和方法在实际应用中仍然存在局限性，需要在未来克服。

参考文献：